Anticorps Secondaires

Les enzymes, comme la peroxydase de raifort (HRP, de l'anglais « horseradish peroxidase » ) ou la phosphatase alcaline (AP), peuvent se conjuguer à un anticorps via des liaisons covalentes. Les anticorps conjugués aux enzymes sont utilisés en conjonction avec un substrat, fluorogène, colorimétrique ou chimioluminescent, pour créer un signal détectable. Le substrat soluble non détectable est converti par l'enzyme en une forme détectable (et normalement insoluble). Les anticorps conjugués aux enzymes permettent l'amplification du signal; comme l'enzyme est capable de convertir de nombreuses molécules du substrat, la durée pendant laquelle la réaction peut se poursuivre détermine la force du signal.

Peroxydase de Raifort

La peroxydase de raifort (HRP) est une enzyme dérivée de la racine d'Armoracia rustiqueana (alias la plante de raifort) qui est couramment utilisée comme protéine rapporteur. Les anticorps secondaires conjugués au HRP peuvent être utilisés pour la détection colorimétrique, où le HRP catalyse la conversion d'un substrat chromogène en un précipité coloré, ou pour la détection chimioluminescente, où le HRP produit un signal en oxydant un substrat chimiluminescent en une forme qui émet de la lumière.

Plusieurs molécules de HRP peuvent se lier à un seul anticorps secondaire, en tant que tel, des anticorps secondaires conjugués à HRP peuvent être utilisés pour améliorer le signal et permettre la détection de protéines exprimées à de faibles niveaux. HRP a également un taux de rotation élevé qui permet aux anticorps secondaires conjugués à HRP de générer un signal fort en peu de temps (souvent en moins de cinq minutes).

Phosphatase Alcaline

Les anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline (AP) sont couramment utilisés pour ELISA et western blot. Ils sont également parfois utilisés pour l'immunohistochimie, mais leur grande taille peut limiter la pénétration dans les tissus. Il convient de noter que, alors que le HRP génère un signal maximal rapidement, souvent en moins de cinq minutes, le signal de l'AP augmente progressivement et culmine à environ une heure. AP génère un signal très stable qui peut durer plusieurs jours; cela est particulièrement utile si plusieurs expositions sont nécessaires, en particulier sur une question de jours.

Vous essayez de choisir entre HRP et AP pour votre blot ?

Utilisez notre tableau ci-dessous pour vous aider à prendre la décision.

Biotine

La biotine est une petite vitamine B soluble dans l'eau qui peut être liée par l'avidine, la Neutravidine et la streptavidine avec une affinité élevée. En raison de sa petite taille, la liaison avec la biotine n'affecte généralement pas l'activité biologique d'une protéine. De multiples molécules de biotine peuvent se conjuguer à un seul anticorps secondaire, en tant que tel, des anticorps secondaires conjugués à la biotine peuvent être utilisés pour améliorer le signal et permettre la détection de protéines exprimées à de faibles niveaux. La visualisation se produit par l'interaction biotine / streptavidine par laquelle la streptavidine est liée à HRP ou à une sonde fluorescente. En utilisant un anticorps secondaire conjugué à la biotine, le même anticorps secondaire peut être utilisé dans de multiples applications simplement en changeant la streptavidine utilisée.

Les anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent permettent un signal plus lumineux et offrent la possibilité de distinguer plusieurs protéines dans un seul échantillon, en tant que tels, ils sont un outil précieux pour identifier les protéines en immunocytochimie, western blotting, immunofluorescence, immunohistochimie et de nombreuses autres applications . Les colorants fluorescents courants incluent la gamme Alexa Fluor, AMCA, Cy3, FITC, PE et TRITC.

Exemples de Détection Fluorescente :

Un anticorps est une glycoprotéine "en forme de Y" qui est capable de se lier à des antigènes spécifiques. Chaque anticorps est composé de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques, dont la séquence et la longueur varient entre les espèces et entre les classes d'isotypes. La structure d'un anticorps peut être décomposée en : deux régions F(ab), les sections supérieures du « Y » qui contiennent la région variable qui se lie spécifiquement à un épitope particulier sur l'antigène ; une région charnière ; et une région Fc, le bas du "Y" qui fournit un site de liaison pour les récepteurs Fc endogènes (et les anticorps secondaires).

Chez les mammifères, les anticorps sont classés en cinq classes principales ou isotypes selon la chaîne lourde qu'ils contiennent. Ce sont : IgA (alpha), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) et IgM (mu). Chaque classe diffère par la séquence de domaines constants, le nombre de domaines constants, la structure charnière et la valence de l'anticorps. Les chaînes légères d'un anticorps sont classées comme kappa ou lambda en fonction de leur séquence polypeptidique. Typiquement, les deux chaînes légères dans un anticorps individuel sont du même type.

Les anticorps entiers peuvent être digérés par la papaïne ou la pepsine pour former des fragments-anticorps F(ab), F(ab') et F(ab')₂, qui n'ont pas de portion Fc ou une portion Fc significativement réduite. La structure des fragments F(ab), F(ab') et F(ab')₂ diffère : les fragments F(ab) sont une seule portion de liaison à l'antigène, les fragments F(ab') sont une seule portion F(ab) avec le région charnière présente, et les fragments F(ab')₂ sont deux parties F(ab) liées via la région charnière. Le fragment d'anticorps secondaires F(ab), F(ab') et F(ab')₂ sont utilisés pour empêcher la liaison non spécifique entre la région Fc d'un anticorps et le récepteur Fc sur une cellule.

Classes et Sous-Classes d'Anticorps

L'espèce de l'anticorps secondaire dépend de l'espèce hôte de l'anticorps primaire que vous utilisez. Des anticorps secondaires sont développés contre une classe ou une sous-classe d'immunoglobulines d'une espèce spécifique. Vous devez sélectionner un anticorps secondaire qui a été produit dans une espèce différente contre l'espèce hôte et l'isotype de l'anticorps primaire. Par exemple, si vous avez utilisé un anticorps primaire polyclonal élevé chez la chèvre, vous aurez besoin d'un anticorps secondaire anti-chèvre IgG (chaînes lourdes et légères) créé dans une espèce différente.

Les anticorps secondaires purifiés par affinité subissent un processus pour éliminer les anticorps secondaires non spécifiques à une classe ; en conséquence, ces anticorps secondaires produisent moins de signal de fond et sont un choix populaire parmi les chercheurs. Par exemple, un anticorps secondaire de lapin anti-IgG2a de souris serait purifié par affinité en utilisant une IgG2a de souris immobilisée pour purifier tous les anticorps de lapin qui se lient à l'IgG2a de souris. Ces anticorps anti-IgG2a peuvent ensuite être purifiés davantage par passage à travers une ou des colonnes de chromatographie contenant des IgE, IgG1, IgG2b, IgG3 et IgG4 de souris (etc.) ; cela supprime tous les anticorps qui réagissent également de manière croisée avec des isotypes autres que l'IgG2a.

Les anticorps fragment F(ab), F(ab') et F(ab')₂ sont utilisés pour éliminer la liaison non spécifique entre la région Fc d'un anticorps et le récepteur Fc sur une cellule. Ces fragments d'anticorps se lient toujours aux antigènes mais n'ont soit aucune portion Fc, soit une portion Fc significativement réduite (en raison de leur digestion par la papaïne ou la pepsine). La structure des fragments F(ab), F(ab') et F(ab')₂ diffère : les fragments F(ab) sont une seule portion de liaison à l'antigène, les fragments F(ab') sont une seule portion F(ab) avec le région charnière présente, et les fragments F(ab')₂ sont deux parties F(ab) liées via la région charnière. C'est une bonne idée d'utiliser un anticorps fragment F(ab), F(ab') ou F(ab')₂ lorsque vous travaillez avec des échantillons qui expriment des niveaux élevés de récepteurs Fc.

La pré-adsorption est utilisée pour augmenter la spécificité d'un anticorps secondaire afin de minimiser toute liaison non spécifique. Si vous prévoyez une coloration avec plusieurs anticorps primaires et plusieurs anticorps secondaires simultanément, vous devriez envisager d'utiliser des anticorps secondaires pré-absorbés. La pré-adsorption réduit la réactivité croisée entre l'anticorps secondaire et toute immunoglobuline endogène présente dans l'échantillon.

Afin de créer des anticorps secondaires pré-adsorbés, les anticorps secondaires sont passés à travers une matrice contenant des protéines sériques immobilisées d'une gamme d'espèces ; tout anticorps qui réagit de manière croisée est capturé par la matrice et retiré de l'échantillon. En conséquence, les anticorps secondaires pré-absorbés ne contiennent que des anticorps qui reconnaissent spécifiquement l'anticorps primaire souhaité.

Un anticorps primaire se lie directement à des antigènes spécifiques, avec une spécificité et une affinité élevées, dans le but de purifier ou de détecter et de mesurer les antigènes. Les anticorps primaires peuvent être développés sous forme d'anticorps monoclonaux, qui se lient à un épitope spécifique sur l'antigène, ou ils peuvent être des anticorps polyclonaux, qui se lient à plusieurs épitopes différents sur l'antigène. Les anticorps primaires peuvent être fournis non conjugués ou directement conjugués avec une enzyme (comme HRP ou AP) ou un fluorophore (comme Cy3 ou FITC) pour permettre la visualisation. Des anticorps secondaires sont développés pour lier des isotypes spécifiques d'anticorps primaires. Si un anticorps primaire n'est pas conjugué, il ne peut pas être visualisé sans l'ajout d'un anticorps secondaire conjugué qui se lie à l'anticorps primaire. L'anticorps secondaire sera conjugué soit à une enzyme soit à un fluorophore pour permettre la visualisation.

Un contrôle secondaire uniquement est l'endroit où les échantillons sont incubés avec du PBS ou un diluant d'anticorps, au lieu de l'anticorps primaire. Il est important que le reste du protocole soit identique aux autres échantillons. Ce contrôle permet de déterminer la spécificité de la coloration/signal observé. Aucune coloration dans le contrôle secondaire uniquement implique que la coloration observée dans les autres échantillons est spécifique et générée à partir de l'anticorps secondaire se liant uniquement à l'anticorps primaire. Une coloration considérable dans le contrôle secondaire uniquement implique que la coloration (pour tous les échantillons) est non spécifique et provient de la liaison de l'anticorps secondaire aux immunoglobulines endogènes présentes dans le tissu ou à certains autres antigènes non cibles.

Les anticorps secondaires permettent une amplification du signal qui peut améliorer la sensibilité d'un dosage et permettre la détection de protéines exprimées à de faibles niveaux. L'amplification du signal peut être soit le résultat direct de la liaison de plusieurs anticorps secondaires à un seul anticorps primaire, soit le résultat de l'utilisation d'un anticorps secondaire conjugué à une enzyme. (c'est-à-dire que plus une réaction est autorisée à se poursuivre, plus la force du signal est grande).

À une concentration élevée, certains anticorps peuvent former des agrégats qui peuvent entraîner un signal moucheté dans les tests d'immunocoloration. La centrifugation du flacon d'anticorps à grande vitesse pendant 10 à 15 minutes et le pipetage précautionneux de la solution d'anticorps (il est important de veiller à ne pas toucher le fond du flacon) peuvent aider à éliminer les agrégats qui auraient pu se former. Il vaut également la peine de vérifier que les lames et les lamelles sont propres, car cela peut également donner l'apparence de mouchetures. S'ils ont l'air sales au microscope, nettoyez-les avec de l'alcool à 100 %.

Lorsque vous effectuez une expérience multi-label, vous devez viser à n'utiliser que des anticorps secondaires produits dans la même espèce. Cela garantit que les anticorps secondaires ne reconnaîtront que l'anticorps primaire prévu et non d'autres anticorps secondaires.

Le type d'étiquette que vous choisirez dépendra de la technique que vous utilisez. Par exemple, des anticorps secondaires conjugués à une enzyme (tels que HRP ou AP) sont couramment utilisés pour l'ELISA et l'immunotransfert. La HRP est à la fois une enzyme économique et stable, cependant, l'AP peut être plus sensible dans certaines situations (c'est-à-dire pour l'analyse colorimétrique).

Pour la cytométrie en flux, l'immunohistochimie et l'immunofluorescence, les marqueurs idéaux peuvent être des enzymes ou des fluorochromes. La coloration DAB est efficace en tant que marqueur unique ou en tant que deuxième couleur pour le marquage de plusieurs antigènes en IHC. Alternativement, un système biotine/avidine en deux étapes peut être utilisé pour l'amélioration du signal et pour permettre la détection de protéines exprimées à de faibles niveaux.

La structure de votre anticorps primaire et de votre anticorps secondaire peut ou non être la même selon l'hôte, la clonalité et l'isotype des anticorps que vous sélectionnez.

Un anticorps est une glycoprotéine « en forme de Y » qui est capable de se lier à des antigènes spécifiques. Chaque anticorps est composé de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques, dont la séquence et la longueur varient entre les espèces et entre les classes d'isotypes. La structure d'un anticorps peut être décomposée en : deux régions F(ab), les sections supérieures du « Y » qui contiennent la région variable qui se lie spécifiquement à un épitope particulier sur l'antigène ; une région charnière ; et une région Fc, le bas du « Y » qui fournit un site de liaison pour les récepteurs Fc endogènes (et les anticorps secondaires).

Chez les mammifères, les anticorps sont classés en cinq classes principales ou isotypes selon la chaîne lourde qu'ils contiennent. Ce sont : IgA (alpha), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) et IgM (mu). Chaque classe diffère par la séquence de domaines constants, le nombre de domaines constants, la structure charnière et la valence de l'anticorps.

Les chaînes légères d'un anticorps sont classées comme kappa ou lambda en fonction de leur séquence polypeptidique. Typiquement, les deux chaînes légères dans un anticorps individuel sont du même type. Par conséquent, les différences structurelles entre les anticorps primaires et secondaires dépendent de l'espèce, de l'isotype, de la clonalité et de la spécificité de la cible des deux anticorps.